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本項(xiàng)目擬基于團(tuán)隊(duì)在核酸探針和核酸擴(kuò)增技術(shù)方面的技術(shù)積累，構(gòu)建基于核酸適配體變構(gòu)響應(yīng)的黃曲霉毒素B1的均相快速分析方法，并構(gòu)建基于核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)真菌毒素微生物的鑒定篩查技術(shù)，以此構(gòu)建一套黃曲霉毒素B1污染風(fēng)險快速評估技術(shù)平臺。核酸適配體是一類新型的具有分子識別性的單核酸鏈。相比抗體，核酸適配體具有結(jié)構(gòu)響應(yīng)性（可構(gòu)建均相的檢測方法，不要洗滌和標(biāo)記）、穩(wěn)定和廉價等優(yōu)勢?；诤怂徇m配體為識別元件，有望構(gòu)建不依賴分離的、快速響應(yīng)、直輸光學(xué)信號的黃曲霉毒素B1檢測技術(shù)。核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，包括滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，能夠在固定溫度、一個離心管里邊實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)核酸高效（107）和快速（20分鐘）擴(kuò)增，免除了昂貴的控溫設(shè)備（PCR儀），因此更容易實(shí)現(xiàn)檢測技術(shù)的推廣。同時核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能夠抗樣品基質(zhì)的干擾，可以實(shí)現(xiàn)樣品初提產(chǎn)物的直接擴(kuò)增，極大地減少了樣品處理時間。因此，基于核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的基因檢測平臺有望實(shí)現(xiàn)產(chǎn)真菌毒素微生物的現(xiàn)場快速檢測。

1. 基于核酸適配體變構(gòu)效應(yīng)的黃曲霉毒素均相快速分析 相比抗體，靶標(biāo)分子的結(jié)合能夠引發(fā)核酸適配體的變構(gòu)。但是核酸適配體的變構(gòu)很難直接輸出高靈敏的靶標(biāo)分子響應(yīng)信號。我們團(tuán)隊(duì)通過核酸探針結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、熒光能量轉(zhuǎn)移過程構(gòu)建以及新型核酸染料應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了變構(gòu)過程的距離效應(yīng)和結(jié)構(gòu)效應(yīng)的綜合增強(qiáng)（圖3,4），將基于適配體變構(gòu)響應(yīng)原理的黃曲霉毒素B1的檢測靈敏度提高了103倍，黃曲霉毒素B1的檢出限達(dá)到1 μg/kg，低于國標(biāo)的限量要求。特別的，通過響應(yīng)協(xié)同設(shè)計(jì)，我們構(gòu)建了基于單核酸適配體鏈的黃曲霉毒素B1的快速檢測方法，并應(yīng)用于包括玉米、花生油、豆瓣醬、土壤和水中黃曲霉毒素B1的快速現(xiàn)場檢測。 2. 基于核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)黃曲霉毒素微生物快速檢測技術(shù) 目前常規(guī)微生物檢測技術(shù)是PCR技術(shù)。但是PCR技術(shù)需要昂貴的設(shè)備，無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測，并且依賴核酸提取過程，操作復(fù)雜且耗時。本項(xiàng)目擬構(gòu)建基于核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)黃曲霉毒素微生物快速檢測方法（圖5）。通過鏈置換探針，鎖式探針以及dCas9探針特異性識別產(chǎn)黃曲霉毒素微生物的核糖體ITS序列。通過恒溫的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、恒溫PCR技術(shù)（RPA）等實(shí)現(xiàn)識別基因的快速高效過程。同時構(gòu)建熒光標(biāo)記探針和核酶催化探針，分別實(shí)現(xiàn)高特異性的熒光及比色檢測方法。對于定量檢測分析，構(gòu)建實(shí)時的熒光檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對產(chǎn)黃曲霉毒素微生物的精準(zhǔn)定量分析。

目前項(xiàng)目研究已經(jīng)初具成果，形成了相關(guān)專利論文等科研成果，現(xiàn)在正處于項(xiàng)目推廣階段。

項(xiàng)目已有研究基礎(chǔ)和技術(shù)指標(biāo) 1.構(gòu)建了基于核酸適配體變構(gòu)技術(shù)的均相不依賴分離的黃曲霉毒素B1識別和檢測方法； 2.構(gòu)建了高靈敏基因檢測芯片，可用于病毒、真菌和細(xì)菌的高靈敏、快速可視化檢測； 3.構(gòu)建了基于核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的不依賴培養(yǎng)的產(chǎn)毒素黃曲霉和寄生曲霉的快速檢測技術(shù)； 4.開發(fā)了便攜熒光和比色檢測設(shè)備（尺寸LWH，40×30×30 cm），正在開發(fā)移動電源供電設(shè)備及手機(jī)可視化檢測平臺，可以實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素B1和產(chǎn)毒素菌的現(xiàn)場快速分析； 5.檢測時間：單次黃曲霉毒素B1檢測時間控制在20分鐘以內(nèi)；產(chǎn)毒素菌檢測時間控制在40分鐘以內(nèi)。 6.檢測靈敏度：黃曲霉毒素B1檢出限可達(dá)到 1 μg/kg；；產(chǎn)毒素菌檢出限可以達(dá)到50個拷貝； 7.檢測穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性：檢測誤差控制在±10%，穩(wěn)定性控制在±5%； 8.已測試檢測樣品：豆瓣醬；花生油；玉米；土壤；水。

目前項(xiàng)目研究已經(jīng)初具成果，形成了相關(guān)專利論文等科研成果，現(xiàn)在正處于項(xiàng)目推廣階段。項(xiàng)目應(yīng)用前景：在糧食生產(chǎn)、貯存及加工過程中作為黃曲霉毒素B1污染及潛在污染（產(chǎn)毒素菌）的檢測和監(jiān)控，特別適用于谷物花生等存儲期間黃曲霉毒素B1的現(xiàn)場快速和包括豆瓣醬等調(diào)味品中黃曲霉毒素B1的篩查。

目前項(xiàng)目正在成果轉(zhuǎn)化階段，通過在企業(yè)實(shí)際檢驗(yàn)檢測中的驗(yàn)證積累，將項(xiàng)目研究成果從易操作、檢驗(yàn)時間短、精準(zhǔn)度高著手，有效推廣到企業(yè)生產(chǎn)過程中。